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主要研究内容及目标


重要微生物的多糖生物合成及其生物学功能,从多糖的角度揭示微生物生长、发育的分子机制,涉及多糖生物合成途径的功能基因组学、糖生物学、糖链代谢酶的生化与分子生物学研究。
开展的研究工作包括:(1)丝状真菌多糖生物合成的功能基因组学研究。通过分离、鉴定及功能分析阐明真菌蛋白糖基化修饰的途径及其生物学功能;(2)细菌胞外多糖的生物合成与功能分析。通过对链球菌、大肠杆菌等细菌胞外多糖合成相关基因的研究阐明其生物合成途径及其功能;(3)古菌糖蛋白生物合成途径及重要基因/酶的分离、研究。

 


主要研究成果简介

 

Fig.1. Pathways and functions of protein glycosylation in A. fumigatus. In A. fumigatus, the activation of mannose initiates from formation of mannose 6-phosphate (Man-6-P), which occurs by one of two routes: direct phosphorylation of mannose by hexokinase or interconversion from fructose 6-phosphate (Fru-6-P), the latter pathway requires three enzymes: phosphomannose isomerase (PMI), phosphomannomutase (PMM) and GDP-mannose pyrophosphorylase (GMPP). Pmi1p (AFUA_1G13280), Sec53p (AFUA_6G06580) and Srb1p (AFUA_6G07620) have been annotated as PMI, PMM and GMPP, respectively. Functional analyses of Pmi1p and Srb1 imply that mannose activation is specifically crucial for the synthesis and organization of the cell wall and thus essential for survival of A. fumigatus. The N-glycosylation is initiated by transfer of Dol-PP-linked Glc3Man9GlcNAc2 to an asparagine residue within an N-X-T/S consensus sequence of a nascent peptide, which is catalyzed by Stt3p (AFUA_8G04430), a putative catalytic subunit of the oligosaccharyltransferase (OST) complex. Subsequently, the N-glycan is processed sequentially in the ER and Golgi. N-Glycan processing is initiated by the removal of the glucose residues catalyzed by ER glucosidase I Cwh41p (AFUA_6G04210) and glucosidase II (AFUA_5G03500) to the monoglucosylated form, which is bound by calnexin (AFUA_4G12850). For many glycoproteins, the interaction with calnexin slows down the rate of folding but increases efficiency. GII-catalyzed removal of the third glucose residue follows the dissociation of folding substrates from calnexin and is required for the release of properly folded proteins from the ER and transport to the Golgi. When correct folding is not achieved, the folding sensor peptide:glucosyltransferase (GT) (AFUA_2G02360) adds back a terminal glucose to promote re-association of non-native polypeptides released from calnexin, thus prolonging their retention in the ER folding environment. Cycles of de-/re-glucosylation might be protracted until the polypeptide released from calnexin fulfills quality control requirements. Misfolded proteins are removed by an ER-specific N-glycan-dependent pathway of degradation. Ams1p (AFUA_3G08200) has been identified as vacuole-mannosidase that is involved in degradation of N-glycans. Once the native proteins are released from calnexin, the N-glycan is further processed by a yet unknown ER mannosidase to form Man8GlcNAc2. Then N-glycosylated proteins are transported into the Golgi, where the N-glycan is trimmed by MsdSp (AFUA_1G14560) to yield Man6GlcNAc2. When N-glycosylation is inhibited in A. fumigatus, the most commonly observed effects are cell wall defects and abnormal polarity, which are likely due to the generation of misfolded, aggregated proteins that are required for cell wall synthesis. The O-mannosylation is catalyzed by Pmt1p (AFUA_3G06450), Pmt2p (AFUA_1G07690) and Pmt4p (AFUA_8G04500), which function independently and are required for cell wall synthesis, thermotolerance, and polarity. Pig-ap (AFUA_1G16950) has been identified as the catalytic subunit of the glycosylphosphatidylinositol-N-acetyl- glucosaminyltransferase (GPI-GnT) complex. GPI-anchoring is required for cell wall synthesis, morphology, and virulence.

 

已取得的主要研究成果:
1.蛋白质糖基化修饰途径及其功能的研究
1.1 糖链结构及糖基化生物合成途径的分析
糖基化功能研究的核心是阐明糖链结构与功能关系,为此我们对烟曲霉糖蛋白ChiB1进行了深入研究,解析了该天然糖蛋白的晶体结构,从结构上证明ChiB1上有一条N-糖链(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 60: 939, 2004);建立了糖链结构分析方法并揭示了ChiB1上的N-糖链为Man6GlcNAc2-Asn,O-糖链为Man-Thr/Ser,与哺乳动物细胞的糖基化修饰类似,而与酵母显著不同(Microbiol, 154: 1960, 2008; FEMS Microbiol Lett, 289:155, 2008)。
基于蛋白质糖基化修饰的结构特征,应用生物信息学方法初步推测出烟曲霉糖基化(包括N-糖基化、O-糖基化和GPI修饰)的生物合成途径。为从全局上揭示糖基化修饰的生物合成途径,我们还建立了一种基于SDS-PAGE分离、胶内消化及2D LC-MS/MS检测膜蛋白的新方法,并从烟曲霉中明确鉴定到530个膜蛋白,其中有29种蛋白pI<5、36种蛋白pI>11,另有45种分子量 > 100KD的膜蛋白,比传统方法的分辨率更高;通过该研究我们确定了N-糖基化、O-糖基化、GPI修饰及糖脂的生物合成途径;还发现了细胞壁合成及细胞膜麦角甾醇生物合成途径中潜在的药物靶点(Mol Biotechnol, 44:177, 2010)。
这些结果为研究烟曲霉蛋白质糖基化的结构与功能关系奠定了知识和技术基础,为系统研究糖基化机制提供了候选基因。

1.2 糖基化修饰前体的合成
考虑到甘露糖(Man)是蛋白质N-、O-糖基化和GPI修饰的重要组分,也是烟曲霉细胞壁的结构组分,我们重点对Man前体的合成途径进行了研究。发现pmi1srb1基因均是必需基因,负责多糖与糖蛋白前体GDP-Man的合成。其中srb1基因表达下调时烟曲霉发生菌丝自溶、细胞壁缺陷,同时孢子萌发加快、形成孢子的能力下降;但细胞仍具有极性生长和形成分隔的能力(Microbiol, 154:2730, 2008)。而pmi1基因敲除后,突变株只能在补充外源Man的情况下生长。补充低浓度外源Man时,突变株蛋白质糖基化修饰不足,细胞壁alpha-葡聚糖含量减少,菌丝顶端及部分基细胞膨大呈球状并死亡;补充高浓度外源Man时,突变株表观上生长正常,蛋白质糖基化修饰也未受影响,但细胞壁alpha-葡聚糖含量也减少,突变株形态发生变化,细胞核有丝分裂加快。生化与代谢流分析发现外源补充的高浓度或低浓度Man均导致Man-6-P在突变株中积累并产生细胞毒性。这些结果揭示Pmi1蛋白在能量代谢和细胞壁合成之间起关键的调控作用,而且其底物亲和力与动物或人的同源蛋白不同,有可能成为一个新的药物靶分子(Microbiol, 155: 3281, 2009)。
这些研究结果明确了糖基化修饰与烟曲霉细胞壁完整性、形态发生和存活的相关性。

1.3 N-糖基化修饰的功能分析
我们的研究表明烟曲霉蛋白质在内质网中合成时会被N-糖链前体Glc3Man9GlcNAc2修饰,与蛋白共价连接的N-糖链前体在ER中被进一步加工为Man8GlcNAc2糖型后,糖蛋白被转运到高尔基体。其中cwh41基因负责N-糖链前体在ER中加工的第一步,该基因缺失后N-糖链加工被阻断,以分泌糖蛋白ChiB1为报告分子进行糖链分析发现其N-糖链未经加工,仍为Glc3Man9GlcNAc2,虽有一部分ChiB1能分泌,但还有一部分在胞内积累并被降解;突变株的细胞壁发生缺陷、极性生长异常,Rho-type GTPase和Cdc42的表达显著上调(FEMS Microbiol Lett, 289:155, 2008)。蛋白质组学分析发现突变株中的分子伴侣钙粘蛋白与Lhslp(Hsp70分子伴侣)、泛素介导的蛋白质降解相关蛋白表达上调,说明突变株的ER中有未折叠蛋白的积累并导致ER-stress;同时与肌动蛋白细胞骨架重排相关的蛋白不表达或表达下调,细胞生物学分析证明突变株丧失了肌动蛋白细胞骨架重排的能力(Microbiol, 155: 2157, 2009)。这些结果证明烟曲霉与酵母不同,已进化出了类似于哺乳动物细胞的N-糖链依赖的蛋白质折叠质量控制体系,发现N-糖基化在ER中的加工不仅与细胞壁合成相关,而且还与细胞极性生长、形态发生直接相关。
我们的研究表明,当糖蛋白在ER中完成加工后被转运到Golgi,由msdS基因负责糖蛋白的进一步加工、成熟。以ChiB1为报告分子的研究表明糖蛋白上的N-糖链在MsdS的作用下由Man8GlcNAc2加工为Man6GlcNAc2,然后成熟糖蛋白被转运到细胞膜、细胞壁或被分泌到细胞外。该基因被敲除后, N-糖链不能被加工为成熟糖蛋白的糖型,突变株细胞壁多糖组分减少、形成孢子的能力下降,并且在孢子萌发、菌丝生长及孢子形成时期,突变株表现出极性建立、极性维持及细胞分隔异常,说明N-糖链在Golgi中的加工也与细胞壁合成及形态发生密切相关(Microbiol, 154:1960, 2008)。
根据上述研究结果,我们提出了一个假说(图2):某些细胞壁合成所需的酶(如glucan synthase)或细胞表面的感应分子是糖蛋白,N-糖基化修饰可能是这些糖蛋白的折叠、转运及功能所需要的。当N-糖基化修饰发生缺陷时(如cwh41基因缺失),导致细胞壁合成所需的酶不能正确折叠并行使功能,这些未正确折叠的蛋白可能被蛋白酶体降解,导致细胞壁发生缺陷;该缺陷经细胞表面感应分子感应后,通过Rsr1-Cdc42-Rho1-MpkA途径激活细胞壁合成相关基因的表达以补偿细胞壁缺陷;同时,Cdc42也是肌动蛋白细胞骨架调控的上游信号分子,Cdc42的激活可能是糖基化突变株形态发生异常的原因之一(FEMS Microbiol Lett, 289:155, 2008; Microbiol, 155: 2157, 2009)。

Fig. 2. Proposed model of functions of N-glycosylation in A. fumigatus. Proteins that are required for cell wall synthesis or cell wall stress sensing require N-glycosylation for their proper folding, localization and function. Disruption of N-glycosylation in A. fumigatus results in misfolding and degradation of these proteins, which thus causes cell wall defects and then leads to the activation of the Rho-type GTPases (Rsr1p/Bud1p-Cdc42p-Rho1p)-mediated CWI pathway to compensate for cell wall defects. Meanwhile activation of the Cdc42 in the CWI pathway also activates SepA, an upstream component of actin re-arrangement, leading to abnormalities in polarized growth.


此外,我们还证明ams1基因负责N-糖链在液泡/溶酶体中的降解,ams1基因所编码的蛋白与人溶酶体alpha-甘露糖苷酶Man2C1p、酵母及构巢曲霉的II型alpha-甘露糖苷酶同源。Man2C1缺损会导致人类alpha-甘露糖贮积症,表现为严重的神经发育障碍等;而在酵母与构巢曲霉中,II型alpha-甘露糖苷酶只担负营养功能,该酶缺失后并不表现任何表型。我们的研究显示,烟曲霉ams1基因的缺失虽不影响细胞壁完整性,却会导致细胞壁糖蛋白的过度甘露糖基化,突变株细胞膨大、细胞中有更多的细胞核,形成孢子的能力下降、细胞极性生长与细胞分隔异常,说明烟曲霉与哺乳动物细胞一样,其糖蛋白N-糖链的降解缺陷也会影响细胞的功能(Glycobiol, 19: 624, 2009)。

1.4 O-糖基化修饰的功能分析
O-甘露糖基化(O-Man)是一种从真菌到人类都保守的蛋白质修饰,果蝇的O-Man缺陷导致肌生成缺陷、不育和寿命缩短;小鼠O-Man缺陷可导致胚胎期死亡;人类的Walker-Warburg 综合征(WWS)也是O-Man缺陷的遗传病,表现为肌肉萎缩、神经发育障碍等。但O-Man的功能及相关疾病的机制还不清楚。
我们的研究证明烟曲霉pmt1pmt2基因负责蛋白质的O-Man。烟曲霉是一种能在30-55度正常生长的真菌,当pmt1基因被敲除后,突变株的蛋白质O-Man修饰减少了60%,突变株在37度时能生长正常,毒力未受影响;但在42或50度时表现出严重的细胞壁缺陷、生长受抑制并丧失形成孢子的能力,说明pmt1基因是烟曲霉细胞壁完整性及热适应性所必需的(Eukaryotic Cell, 6:2260, 2007)。与pmt1不同,pmt2基因可能是生长所必需的基因,该基因表达下调导致生长变慢、孢子萌发滞后、形成孢子的能力下降,细胞壁发生缺陷、细胞周期改变、形态发生异常,但并未表现出温度敏感性,说明pmt1pmt2虽然编码的是同功酶,但它们所担负的功能截然不同(Glycobiol, 20:542, 2010)。这些研究结果揭示了烟曲霉O-Man的生理功能,为深入研究O-Man在真核细胞生长发育中的作用奠定了基础,也为研究WWS的机制提供了一个简单的模型。

1.5 GPI修饰的功能分析
蛋白质可以通过GPI修饰被锚定到细胞质膜上。GPI修饰的蛋白分布广泛,从原虫的被膜蛋白到哺乳动物神经细胞的黏附因子,具有重要的生理功能。虽然真菌也产生GPI,但对其结构和生物合成的研究还非常有限。我们建立了一种新的GPI糖链测定方法,从生化上证明烟曲霉pig-a基因编码的蛋白负责催化GPI合成的第一步反应;敲除pig-a基因后,突变株虽能存活,但GPI蛋白完全缺失,突变株生长受抑制、细胞膨大、裂解增加,细胞壁发生缺陷并出现双层细胞壁的现象,对突变株的分泌蛋白质组分析发现2个与毒力相关的蛋白缺失,在小鼠感染模型中突变株的毒力显著减弱(Mol Microbiol, 64: 1014, 2007)。这一研究结果证明pig-a是毒力相关基因,蛋白质的GPI修饰对细胞壁合成、细胞生长与发育至关重要。由于在酵母和小鼠中敲除pig-a的同源基因均导致致死表型,我们的研究为了解GPI修饰的功能及调控机制提供了可能。
在此基础上,我们还发现该突变株的MAPK(mitogen-activated protein kinases)信号通路中的蛋白激酶A(MpkA)组成型上调,细胞壁合成、色素合成、孢子形成等相关基因的表达发生变化。另外,通过对烟曲霉GPI蛋白的研究和分析,确定了PhoA蛋白GPI修饰的细胞膜定位功能(微生物学报, 48: 1330, 2008)。构建了一个可在烟曲霉中表达外源蛋白的载体,并通过共转化提高了转化效率,为烟曲霉基因与蛋白质功能的研究提供了一个有效表达系统;还建立了将蛋白质定向表达于细胞膜或细胞壁的技术,已申请专利4项(申请号:200810240800.5; 200810241009.6; 200810241003.9; 200810241010.9)。

2.其他重要工作
E. coli K1菌株是新生儿脑膜炎的致病菌,其荚膜由alpha-2, 8-唾液酸多糖构成,与致病性有关。为研究其荚膜多糖的生物合成与功能,我们从E. coli K1中克隆了合成荚膜的关键基因neuA(J Mol Catalysis B: Enzymatic, 10:201, 2000),发现NeuA是同时具有CMP-唾液酸合成酶和O-乙酰水解酶活性的双功能蛋白(生物工程学报, 18:676, 2002;J Biol Chem, 279:17738, 2004)。最近还发现2型猪链球菌(SS2)中也有同源的双功能酶,该酶的性质与大肠杆菌NeuA有显著不同;我们的研究证明NeuA中的O-乙酰水解酶活性是合成荚膜唾液酸所必需的(Biochem. Biophys. Res. Commun., 410: 21, 2011),提出了新的大肠杆菌、猪链球菌荚膜唾液酸合成与调控的新机制,为药物开发提供了新的靶分子(图3)。

Fig.3. Model for O-acetylation of the capsular Neu5Ac in E. coli. In E. coli, the esterase activity associated with the NeuA preferentially acts on CMP-O-acetyl-Neu5Ac. This bacterium synthesizes and modulates its capsular Neu5Ac by using de-O-acetylated CMP-O-acetyl-Neu5Ac and CMP-O-acetyl-Neu5Ac, which are come from O-acetylation of free Neu5Ac followed by activation of O-acetyl-Neu5Ac.